| 枫林在线论坛精华区>>学习交流 |
| [228738] 主题： “小”提质粒的“大”学问(转载) |
| 作者： bathory (muttoooooooon) | ||
| 标题： “小”提质粒的“大”学问(转载) | ||
| 来自： 218.80.*.* | ||
| 发贴时间： 2004年06月07日 18:15:06 | ||
| 长度： 7211字 | ||
|
复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享：
从质粒抽提谈起 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要 用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都 知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克 隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途 的主要原因。后 来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多 “老师”也是这 个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的 观念深入人 心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所 以这读书的定义 就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没 有在中国萌发的 根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国 真正扎根的，它 只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了， 那我想问有 那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？ 可是光动手不思 考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完 善自己。一个杰 出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。 每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国 的未来有希 望。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H，因此用适当 浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡 萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮 后的大肠杆菌不 会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽 提本身而言， 几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知 道EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是： 抑制DNase的活 性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要 把大肠杆菌细胞 中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的 ，只要不磨洋工 ，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因 为最终溶解质 粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质 粒呢？实话告 诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能 忘的是，菌体一 定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的 。要新从浓 NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减 弱了碱性。很 多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实 上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解 ，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结 构的相变化所导 致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不 妨可以自己试 一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少 量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基 因组DNA变性， 以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导 致。有人不禁 要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做 的铺垫。这一 步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在 这样的碱性条件 下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样） ，不然基因组 DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这 沉淀的本质。 最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的SDS溶液中 加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS的加入有关 系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得 多，显然是盐 析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是 遇盐发生的沉 淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下 是会产生沉淀的 。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl， 你会发现沉淀的 量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇 到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的 沉淀实际上是 钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉 淀更完全。大家 知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾 钠离子置换所产 生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的 基因组DNA也一 起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自 然容易被PDS给 共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的 呢？是为了中 和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一 旦发生断裂，只 要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的 时间要短，而 且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼 脂糖电泳可以 观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无 法快速复性就 被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性 溶液中都是溶 解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物， 与它是不是沉 淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS沉淀更充分 一点。 不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质 不能被沉淀， 因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定 的质粒DNA，不 然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/ 异戊醇是有很多 道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于 氯仿，按道理应 该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到 高浓度的盐溶液 （比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相 的回收；但加入 氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一 点，酚与水有 很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会 抑制很多酶反应 （比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次将水相中的酚 去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的 酚在乙醇沉淀 时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加 ，其作用主要是 为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置 几分钟后 离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃，时间一长反而会 导致大量盐的 沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度 的盐会水合大 量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生 了盐的沉淀， 就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀 打碎，就能得 到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行 溶解，不然大 量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数 情况下你能看到 三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法 抽提得到质粒样 品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳 ，就会看到线性 质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢 而排序，分别 是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起） 。如果你不小心 在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三 条带，是 20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA 序列导致了 不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。这里暂不深究。 想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。留下一个思考题，为什么真核生物 的基因组 DNA不能用碱法抽提？ |
||
|
========== * * * * * ==========
|
| 作者： KID_1412 (无知·云无心以出岫) | ||
| 标题： Re: “小”提质粒的“大”学问(转载) | ||
| 来自： 203.95.*.* | ||
| 发贴时间： 2004年06月07日 20:59:52 | ||
| 长度： 391字 | ||
|
rr地说：首先想到的是真核生物的基因组DNA大概和细菌的DNA一样，会和 变性蛋白质一起缠绕在沉淀中被除去 但是既然这样为什么要强调是“真核生物的基因组DNA”呢？这里面关系到 真核与原核的区别吗？ 希望高手解答：） PS：好文章啊！狂赞 ============================= muttoooooooon在其大作中写道： 想说的，终于说完了。谢谢你的耐心。留下一个思考题，为什么真核生物 的基因组 DNA不能用碱法抽提？ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ※作者已于 2004-06-07 21:00:22 修改本文※ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ |
||
|
========== * * * * * ==========
|
| 作者： KID_1412 (无知·云无心以出岫) | ||
| 标题： Re: “小”提质粒的“大”学问(转载) | ||
| 来自： 203.95.*.* | ||
| 发贴时间： 2004年06月07日 21:06:06 | ||
| 长度： 1222字 | ||
|
另：如果“NaOH是最佳的溶解细胞的试剂”，那么为什么一般实验中仍然 用去垢剂裂解细胞呢？是因为NaOH改变了PH值会造成蛋白质变性之类从而 影响实验结果吗？ ============================= muttoooooooon在其大作中写道：轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的Na OH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减 弱了碱性。很 多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实 上NaOH是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解 ，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结 构的相变化所导 致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不 妨可以自己试 一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少 量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基 因组DNA变性， 以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导 致。有人不禁 要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做 的铺垫。这一 步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在 这样的碱性条件 下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样） ，不然基因组 DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ※作者已于 2004-06-07 21:09:21 修改本文※ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ |
||
|
========== * * * * * ==========
|
| 返回 |